KLONNING DNA DAN DNA REKOMBINAN

 GAMBARAN UMUM KLONING DNA

Pengertian, tujuan, dan langkah dasar kloning DNA.

Rangkuman:

• Kloning DNA adalah teknik biologi molekuler dalam membuat salinan identik dari sepotong DNA, seperti gen.
• Hal khusus dalam eksperimen kloning, adalah gen target dimasukkan ke dalam potongan DNA sirkuler yang disebut plasmid .
• Plasmid dimasukkan kembali kedalam sel bakteri melalui proses yang disebut transformasi.
• Bakteri dengan plasmid yang terbentuk digunakan untuk membuat lebih banyak DNA plasmid atau, dalam beberapa kasus, diinduksi untuk mengekspresikan gen dan membuat protein.

Pendahuluan

Ketika kamu mendengar istilah "kloning", kamu mungkin berpikir tentang kloning seluruh organisme, seperti domba Dolly. Namun, yang dimaksud dengan mengkloning  adalah membuat salinannya yang persis secara genetik. Di laboratorium biologi molekuler, yang paling sering dikloning adalah gen atau potongan kecil DNA lainnya.

Ahli biologi molekuler, mengatakan bahwa "kloning" - maknanya bahwa dia tidak berhasil, menyalin potongan DNA, dan bukan kegagalan dalam membuat domba Dolly berikutnya!

Gambaran umum kloning DNA

Kloning DNA adalah proses membuat salinan identik dari DNA tertentu. Proses kloning dilakukan pada untai DNA yang khas, berupa gen atau fragmen DNA lain yang diinginkan (mungkin gen untuk protein manusia yang bermanfaat secara medis) untai DNA khusus  dimasukkan ke dalam potongan DNA plasmid . Penyisipan dilakukan dengan menggunakan enzim yang "memotong (restriksi) dan menempel (ligase)" DNA, dan menghasilkan molekul DNA rekombinan, atau DNA yang dirakit dari fragmen dari berbagai sumber.

Diagram yang menunjukkan konstruksi molekul DNA rekombinan. Sepotong melingkar DNA plasmid memiliki overhang di ujungnya yang cocok dengan fragmen gen. Fragmen plasmid dan gen bergabung bersama untuk menghasilkan plasmid yang mengandung gen. Plasmid yang mengandung gen ini adalah contoh DNA rekombinan, atau molekul DNA yang dirakit dari DNA dari berbagai sumber.

Selanjutnya, plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam bakteri. Bakteri pembawa plasmid dipilih dan dibesarkan. Saat mereka bereproduksi, mereka mereplikasi plasmid rekombinan tersebut dan menyebarkannya ke keturunan mereka, membuat salinan DNA yang dikandungnya.

Apa gunanya membuat banyak salinan urutan DNA dalam plasmid? Dalam beberapa kasus, kita membutuhkan banyak salinan DNA untuk melakukan eksperimen atau membangun plasmid baru. Dalam kasus lain, potongan DNA mengkode protein yang dibutuhkan manusia, dan bakteri digunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Misalnya, gen insulin manusia diekspresikan dalam bakteri E. coli untuk membuat insulin yang digunakan oleh penderita diabetes.

Langkah-langkah kloning DNA

Kloning DNA digunakan untuk berbagai tujuan. Sebagai contoh, kloning DNA dapat digunakan untuk mensintesis protein (seperti insulin manusia) pada bakteri. Langkah-langkah dasarnya adalah:

1. 'Gunting' plasmid dan "tempel" DNA target. Proses ini bergantung pada enzim restriksi (enzim pemotong DNA) dan DNA ligase (enzim yang menyambung DNA).
2. Masukkan plasmid rekombinan ke dalam sel bakteri. Gunakan seleksi antibiotik untuk mengidentifikasi bakteri yang mengambil plasmid.
3. Tumbuhkan banyak bakteri pembawa plasmid dan gunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Prosuk protein dari bakteri dan bersihkan dengan cara memisahkan produk dengan komponen bakteri.

1. Memotong dan menempel DNA

Bagaimana untai DNA dari sumber berbeda digabungkan? Metode umum menggunakan dua jenis enzim: enzim restriksi dan enzim ligase.

enzim restriksi adalah enzim yang memotong DNA target  secara berurutan dan pemotongan DNA menjadi dua bagian di area DNA tersebut. Enzim restriksi menghasilkan potongan DNA beruntai tunggal. Jika dua molekul memiliki potongan yang sesuai, kedua potongan tersebut dapat menjadi pasangan basa dan saling menempel satu dengan yang lain. Tai kedua untai DNA tersebut tidak akan bergabung membentuk molekul DNA yang utuh sampai keduanya digabungkan dengan DNA ligase.

Tujuan kloning adalah memasukkan gen target (misalnya, gen yang mengkode insulin manusia) ke dalam plasmid. Dengan menggunakan enzim restriksi digunakan untuk:

• Plasmid, yang memiliki satu area yang dapat dipotong potong
• Fragmen gen target, memiliki area potongan di dekat setiap ujungnya

Kemudian, kami menggabungkan fragmen dengan DNA ligase, yang menghubungkannya untuk membuat plasmid rekombinan yang mengandung gen tersebut.

Diagram yang menggambarkan destruksi dan ligasi restriksi dalam skema yang disederhanakan.

Kami mulai dengan plasmid bakteri melingkar dan gen target. Di dua ujung gen target terdapat situs restriksi, atau urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi tertentu. Dalam plasmid, ada juga situs restriksi yang dikenali oleh enzim yang sama, tepat setelah promotor yang akan mendorong ekspresi pada bakteri.

Baik plasmid dan gen target (secara terpisah) dicerna dengan enzim restriksi. Fragmen dimurnikan dan digabungkan. Mereka memiliki "ujung lengket" yang cocok, atau DNA beruntai tunggal yang menggantung, sehingga mereka bisa saling menempel.

Enzim DNA ligase bergabung dengan fragmen dengan ujung yang cocok untuk membentuk molekul DNA tunggal yang tidak terputus. Ini menghasilkan plasmid rekombinan yang mengandung gen target.

2. Transformasi dan seleksi bakteri

Plasmid dan DNA lain dapat dimasukkan ke dalam bakteri, seperti E. coli yang tidak berbahaya yang digunakan di laboratorium, dalam proses yang disebut transformasi . Selama transformasi , sel bakteri yang disiapkan secara khusus diberi kejutan (seperti suhu tinggi) yang mendorong mereka untuk mengambil DNA asing.

DNA yang dihasilkan oleh ligasi (yang mungkin merupakan campuran dari plasmid yang diinginkan, produk samping plasmid, dan potongan DNA linier) ditambahkan ke bakteri. Bakteri diberi kejutan panas, yang membuatnya lebih mudah mengambil DNA melalui transformasi. Namun, hanya sebagian kecil dari bakteri yang berhasil mengambil plasmi

Plasmid biasanya mengandung gen resistensi antibiotik , yang memungkinkan bakteri bertahan hidup dengan adanya antibiotik tertentu. Dengan demikian, bakteri yang mengambil plasmid dapat dipiih pada pelat nutrisi yang mengandung antibiotik. Bakteri tanpa plasmid akan mati, sedangkan bakteri pembawa plasmid dapat hidup dan berkembang biak. Setiap bakteri yang masih hidup akan menghasilkan kelompok kecil, seperti titik, atau koloni , bakteri identik yang semuanya membawa plasmid yang sama.

Panel kiri: Diagram plasmid, menunjukkan bahwa plasmid mengandung gen resistensi antibiotik.

Panel kanan: semua bakteri hasil transformasi ditempatkan di piring antibiotik. Bakteri tanpa plasmid akan mati karena antibiotik. Setiap bakteri dengan plasmid membuat koloni, atau sekelompok bakteri klonal yang semuanya mengandung plasmid yang sama. Koloni yang khas terlihat seperti titik kecil keputihan seukuran kepala peniti.

Tidak semua koloni mengandung plasmid yang tepat. Itu karena, selama ligasi, fragmen DNA tidak selalu "ditempel" persis seperti yang kita inginkan. Sebaliknya, kita harus mengumpulkan DNA dari beberapa koloni dan melihat apakah masing-masing mengandung plasmid yang tepat. Metode seperti pemecahan enzim restriksi dan PCR biasanya digunakan untuk memeriksa plasmid.

3. Produksi protein

Setelah kami menemukan koloni bakteri dengan plasmid yang tepat, kami dapat menumbuhkan kultur besar bakteri pembawa plasmid. Kemudian, kami memberi bakteri sinyal kimia yang memerintahkan mereka untuk membuat protein target.

Bakteri berfungsi sebagai "pabrik" mini, yang menghasilkan protein dalam jumlah besar. Misalnya, jika plasmid kita mengandung gen insulin manusia, bakteri akan mulai mentranskripsikan gen tersebut dan menerjemahkan mRNA untuk menghasilkan banyak molekul protein insulin manusia. 

Koloni yang dipilih dibesarkan dalam kultur besar (mis., Labu 1 liter). Bakteri dalam kultur besar diinduksi untuk mengekspresikan gen yang terkandung dalam plasmid, menyebabkan gen tersebut ditranskripsi menjadi mRNA, dan mRNA tersebut diterjemahkan menjadi protein. Protein yang dikodekan oleh gen terakumulasi di dalam bakteri.

Setelah protein diproduksi, sel bakteri dapat dibelah untuk melepaskannya. Ada banyak protein dan makromolekul lain yang beredar di dalam bakteri selain protein target (misalnya, insulin). Karena itu, protein target harus dimurnikan, atau dipisahkan dari isi sel lainnya dengan teknik biokimia. Protein yang dimurnikan dapat digunakan untuk eksperimen atau, dalam kasus insulin, diberikan kepada pasien.

Kegunaan kloning DNA

Molekul DNA yang dibangun melalui teknik kloning digunakan untuk banyak tujuan dalam biologi molekuler. Daftar contoh singkatnya meliputi:

• Biofarmasi. Kloning DNA dapat digunakan untuk membuat protein manusia dengan aplikasi biomedis, seperti insulin yang disebutkan di atas. Contoh lain dari protein rekombinan termasuk hormon pertumbuhan manusia, yang diberikan kepada pasien yang tidak dapat mensintesis hormon, dan aktivator plasminogen jaringan (tPA), yang digunakan untuk mengobati stroke dan mencegah penggumpalan darah. Protein rekombinan seperti ini sering dibuat dari bakteri.
• Terapi gen. Pada beberapa kelainan genetik, pasien kekurangan bentuk fungsional dari gen tertentu. Terapi gen mencoba memberikan salinan gen normal ke sel-sel tubuh pasien. Misalnya, kloning DNA digunakan untuk membangun plasmid yang mengandung versi normal dari gen yang tidak berfungsi dalam fibrosis kistik. Ketika plasmid dikirim ke paru-paru pasien fibrosis kistik, fungsi paru-paru memburuk lebih cepat$$^ 2kuadrat.
• Analisis gen. Di laboratorium penelitian dasar, ahli biologi sering menggunakan kloning DNA untuk membangun versi gen rekombinan buatan yang membantu mereka memahami bagaimana gen normal dalam suatu organisme berfungsi.

Ini hanyalah beberapa contoh bagaimana kloning DNA digunakan dalam biologi saat ini. Kloning DNA adalah teknik yang sangat umum yang digunakan dalam berbagai macam aplikasi biologi molekuler.