Reaksi berantai polimerase (PCR)
Teknik yang digunakan untuk memperkuat, atau membuat banyak salinan, wilayah target DNA tertentu.
Rangkuman:
- Polymerase chain reaction, atau PCR, adalah teknik yang digunakan membuat banyak salinan DNA dengan urutan tertentu secara in vitro (dalam lab atau tabung reaksi).
- PCR membutuhkan keberadaan DNA polimerase termostabil, Taq polimerase, dan memerlukan DNA primer yang dirancang khusus urutan DNA yang diinginkan.
- Dalam PCR, reaksi berulang kali didaur ulang melalui serangkaian perubahan suhu, yang memungkinkan terbentuknya banyak salinan daerah target diproduksi.
- PCR memiliki banyak penelitian dan aplikasi praktis. Ini secara rutin digunakan dalam kloning DNA, diagnostik medis, dan analisis DNA forensik.
Apa itu PCR?
Polymerase chain reaction ( PCR ) adalah teknik laboratorium umum yang digunakan untuk membuat banyak salinan (jutaan bahkan milyaran salinan DNA) dengan urutan DNA tertentu. Urutan DNA ini biasanya apapun yang diminati pelaku eksperimen. Misalnya, peneliti ingin memahami fungsi gen tertentu, atau memahami penanda genetik yang digunakan oleh ilmuwan forensik untuk mencocokkan DNA yang ditemukan di TKP dengan DNA tersangka.
Tujuan PCR adalah membuat banyak urutan DNA target sehingga dapat dianalisis atau digunakan dengan cara lain. Misalnya, DNA yang diamplifikasi oleh PCR dapat dikirim untuk diurutkan , divisualisasikan dengan elektroforesis gel , atau diklon ke dalam plasmid bakteri untuk penlitian lebih lanjut.
PCR digunakan di banyak bidang biologi dan kedokteran, termasuk penelitian biologi molekuler, diagnostik medis, dan bahkan beberapa cabang ekologi.
Taq polimerase
Sama halnya dengan proses replikasi DNA dalam tubuh organisme, PCR membutuhkan enzim DNA polimerase yang membuat untaian DNA baru, menggunakan untai yang ada sebagai templat. DNA polimerase yang digunakan dalam PCR disebut Taq polimerase, setelah bakteri tahan panas yang diisolasi ( T hermus aq uaticus ).
T. aquaticus hidup di mata air panas dan ventilasi hidrotermal. DNA polimerase-nya sangat tahan panas dan paling aktif di sekitarnya70, °, teks awal, C, teks akhir(suhu di mana DNA polimerase manusia atau E. coli tidak akan berfungsi). Stabilitas panas ini membuat Tag polimerase menjdi ideal digunakan dalam PCR. Seperti yang akan kita lihat, suhu tinggi digunakan berulang kali dalam PCR untuk mengubah sifat DNA template, atau memisahkan untaiannya.
Primer PCR
Seperti DNA polimerase lainnya, DNA tag polimerase hanya dapat membuat DNA jika ada DNA primer. DNA primer adalah urutan pendek nukleotida yang memberikan titik awal untuk sintesis DNA. Dalam reaksi PCR, DNA primer bertindak sebagai pelaku eksperimen yang menentukan wilayah DNA yang akan disalin, atau diperbanyak, oleh DNA primer .
DNA Primer PCR adalah potongan pendek DNA untai tunggal, biasanya di sekelilingnya 20nukleotida panjangnya. Dua DNA primer digunakan dalam setiap reaksi PCR, dan dirancang sedemikian rupa sehingga mengapit wilayah target (wilayah yang harus disalin). Artinya, mereka diberi urutan yang akan membuat mereka mengikat untaian berlawanan dari DNA cetakan, tepat di tepi wilayah yang akan disalin. DNA Primer mengikat ke templat dengan pasangan basa komplementer.
Ketika primer terikat ke templat, mereka dapat diperpanjang oleh DNA polimerase, dan daerah yang terletak di antara mereka akan disalin.
Langkah-langkah PCR
Bahan utama dari reaksi PCR adalah 1) Taq polimerase, 2) DNA primer, 3). DNA cetakan, dan 4) nukleotida. Bahan-bahan tersebut dirakit dalam sebuah tabung, bersama dengan kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melalui siklus pemanasan dan pendinginan berulang kali memungkinkan untai DNA disintesis.
Langkah-langkah dasarnya adalah:
- Denaturasi (96, °, teks awal, C, teks akhir): Pemanasan digunakan untuk memisahkan, atau mengubah sifat, untai DNA. Proses ini menyediakan template untai tunggal untuk langkah berikutnya.
- Anil (55
- 65°, teks awal, C, teks akhir): Dinginkan reaksi sehingga DNA primer dapat mengikat urutan komplementernya pada DNA cetakan untai tunggal. - Ekstensi (72, °, teks awal, C, teks akhir): Naikkan suhu reaksi sehingga Taq polymerase memperluas DNA primer, mensintesis untaian DNA baru.
Siklus ini berulang 25 - 35 kali dalam reaksi PCR yang khas, yang biasanya memakan waktu 2 - 4jam, tergantung pada panjang untai DNA yang sedang disalin. Jika reaksinya efisien (bekerja dengan baik), untai benang target dapat berubah dari satu atau beberapa salinan bahkan menjadi miliaran salinan.
Pada proses ini bukan hanya DNA asli yang digunakan sebagai templat utama. Tapi DNA baru yang terbentuk dalam satu putaran dapat berfungsi sebagai templat di putaran sintesis DNA berikutnya. Ada banyak salinan primer dan banyak molekul tag polimerase yang mengambang di sekitar reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda di setiap putaran siklus. Pola pertumbuhan eksponensial ini ditunjukkan pada gambar di bawah ini.
Menggunakan elektroforesis gel untuk memvisualisasikan hasil PCR
Hasil reaksi PCR biasanya divisualisasikan menggunakan Elektroforesis gel. Elektroforesis gel ini adalah teknik di mana fragmen DNA ditarik melalui matriks gel oleh arus listrik, dan memisahkan fragmen DNA menurut ukurannya. Standar, atau tangga DNA, biasanya disertakan sehingga ukuran fragmen dalam sampel PCR dapat ditentukan.
Fragmen DNA dengan panjang yang sama membentuk "pita" pada gel, yang dapat dilihat dengan mata jika gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA. Misalnya, reaksi PCR menghasilkan a400 pecahan base pair (bp) akan terlihat seperti ini pada gel:
Pita DNA berisi banyak sekali salinan dari daerah DNA target, tidak hanya satu atau beberapa salinan. Karena DNA mikroskopis, banyak salinannya harus ada sebelum kita dapat melihatnya dengan mata. Ini adalah bagian besar mengapa PCR adalah alat penting: PCR menghasilkan salinan yang cukup dari urutan DNA sehingga kita dapat melihat atau memanipulasi untai DNA tersebut.
Aplikasi PCR
Menggunakan PCR, untai DNA dapat ditambahkan jutaan atau milyaran kali, menghasilkan salinan DNA yang cukup untuk dianalisis menggunakan teknik lain. Misalnya, DNA dapat divisualisasikan dengan elektroforesis gel, dikirim untuk mengurutkan, atau dipecah dengan enzim restriksi dan dikloning menjadi plasmid.
PCR banyak digunakan di laboratorium penelitian, dan juga memiliki aplikasi praktis dalam forensik, pengujian genetik, dan diagnostik. Misalnya, PCR digunakan untuk memperkuat gen yang terkait dengan kelainan genetik dari DNA pasien (atau dari DNA janin, dalam kasus pengujian prenatal). PCR juga dapat digunakan untuk menguji bakteri atau virus DNA dalam tubuh pasien: jika ada patogen, dimungkinkan untuk memperkuat daerah DNA-nya dari sampel darah atau jaringan.
Contoh masalah: PCR dalam forensik
Misalkan Anda bekerja di lab forensik. Anda baru saja menerima sampel DNA dari rambut yang tertinggal di TKP, bersama dengan sampel DNA dari tiga tersangka. Tugas mu adalah memeriksa penanda genetik tertentu dan melihat apakah salah satu dari ketiga tersangka cocok dengan DNA rambut untuk penanda ini.
Penanda datang dalam dua alel, atau versi. Satu berisi satu pengulangan (bagian berwarna cokelat di bawah), sedangkan yang lainnya berisi dua salinan pengulangan. Dalam reaksi PCR dengan primer yang mengapit daerah berulang, alel pertama menghasilkan a200 teks awal, b, p, teks akhir Fragmen DNA, sedangkan yang kedua menghasilkan a 300 teks awal, b, p, teks akhir Fragmen DNA:
Kamu melakukan PCR pada empat sampel DNA dan memvisualisasikan hasilnya dengan elektroforesis gel, seperti yang ditunjukkan di bawah ini:
Tidak ada komentar:
Posting Komentar