KLONNING DNA DAN DNA REKOMBINAN

 GAMBARAN UMUM KLONING DNA

Pengertian, tujuan, dan langkah dasar kloning DNA.

Rangkuman:

• Kloning DNA adalah teknik biologi molekuler dalam membuat salinan identik dari sepotong DNA, seperti gen.
• Hal khusus dalam eksperimen kloning, adalah gen target dimasukkan ke dalam potongan DNA sirkuler yang disebut plasmid .
• Plasmid dimasukkan kembali kedalam sel bakteri melalui proses yang disebut transformasi.
• Bakteri dengan plasmid yang terbentuk digunakan untuk membuat lebih banyak DNA plasmid atau, dalam beberapa kasus, diinduksi untuk mengekspresikan gen dan membuat protein.

Pendahuluan

Ketika kamu mendengar istilah "kloning", kamu mungkin berpikir tentang kloning seluruh organisme, seperti domba Dolly. Namun, yang dimaksud dengan mengkloning  adalah membuat salinannya yang persis secara genetik. Di laboratorium biologi molekuler, yang paling sering dikloning adalah gen atau potongan kecil DNA lainnya.

Ahli biologi molekuler, mengatakan bahwa "kloning" - maknanya bahwa dia tidak berhasil, menyalin potongan DNA, dan bukan kegagalan dalam membuat domba Dolly berikutnya!

Gambaran umum kloning DNA

Kloning DNA adalah proses membuat salinan identik dari DNA tertentu. Proses kloning dilakukan pada untai DNA yang khas, berupa gen atau fragmen DNA lain yang diinginkan (mungkin gen untuk protein manusia yang bermanfaat secara medis) untai DNA khusus  dimasukkan ke dalam potongan DNA plasmid . Penyisipan dilakukan dengan menggunakan enzim yang "memotong (restriksi) dan menempel (ligase)" DNA, dan menghasilkan molekul DNA rekombinan, atau DNA yang dirakit dari fragmen dari berbagai sumber.

Diagram yang menunjukkan konstruksi molekul DNA rekombinan. Sepotong melingkar DNA plasmid memiliki overhang di ujungnya yang cocok dengan fragmen gen. Fragmen plasmid dan gen bergabung bersama untuk menghasilkan plasmid yang mengandung gen. Plasmid yang mengandung gen ini adalah contoh DNA rekombinan, atau molekul DNA yang dirakit dari DNA dari berbagai sumber.

Selanjutnya, plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam bakteri. Bakteri pembawa plasmid dipilih dan dibesarkan. Saat mereka bereproduksi, mereka mereplikasi plasmid rekombinan tersebut dan menyebarkannya ke keturunan mereka, membuat salinan DNA yang dikandungnya.

Apa gunanya membuat banyak salinan urutan DNA dalam plasmid? Dalam beberapa kasus, kita membutuhkan banyak salinan DNA untuk melakukan eksperimen atau membangun plasmid baru. Dalam kasus lain, potongan DNA mengkode protein yang dibutuhkan manusia, dan bakteri digunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Misalnya, gen insulin manusia diekspresikan dalam bakteri E. coli untuk membuat insulin yang digunakan oleh penderita diabetes.

Langkah-langkah kloning DNA

Kloning DNA digunakan untuk berbagai tujuan. Sebagai contoh, kloning DNA dapat digunakan untuk mensintesis protein (seperti insulin manusia) pada bakteri. Langkah-langkah dasarnya adalah:

1. 'Gunting' plasmid dan "tempel" DNA target. Proses ini bergantung pada enzim restriksi (enzim pemotong DNA) dan DNA ligase (enzim yang menyambung DNA).
2. Masukkan plasmid rekombinan ke dalam sel bakteri. Gunakan seleksi antibiotik untuk mengidentifikasi bakteri yang mengambil plasmid.
3. Tumbuhkan banyak bakteri pembawa plasmid dan gunakan sebagai "pabrik" untuk membuat protein. Prosuk protein dari bakteri dan bersihkan dengan cara memisahkan produk dengan komponen bakteri.

1. Memotong dan menempel DNA

Bagaimana untai DNA dari sumber berbeda digabungkan? Metode umum menggunakan dua jenis enzim: enzim restriksi dan enzim ligase.

enzim restriksi adalah enzim yang memotong DNA target  secara berurutan dan pemotongan DNA menjadi dua bagian di area DNA tersebut. Enzim restriksi menghasilkan potongan DNA beruntai tunggal. Jika dua molekul memiliki potongan yang sesuai, kedua potongan tersebut dapat menjadi pasangan basa dan saling menempel satu dengan yang lain. Tai kedua untai DNA tersebut tidak akan bergabung membentuk molekul DNA yang utuh sampai keduanya digabungkan dengan DNA ligase.

Tujuan kloning adalah memasukkan gen target (misalnya, gen yang mengkode insulin manusia) ke dalam plasmid. Dengan menggunakan enzim restriksi digunakan untuk:

• Plasmid, yang memiliki satu area yang dapat dipotong potong
• Fragmen gen target, memiliki area potongan di dekat setiap ujungnya

Kemudian, kami menggabungkan fragmen dengan DNA ligase, yang menghubungkannya untuk membuat plasmid rekombinan yang mengandung gen tersebut.

Diagram yang menggambarkan destruksi dan ligasi restriksi dalam skema yang disederhanakan.

Kami mulai dengan plasmid bakteri melingkar dan gen target. Di dua ujung gen target terdapat situs restriksi, atau urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi tertentu. Dalam plasmid, ada juga situs restriksi yang dikenali oleh enzim yang sama, tepat setelah promotor yang akan mendorong ekspresi pada bakteri.

Baik plasmid dan gen target (secara terpisah) dicerna dengan enzim restriksi. Fragmen dimurnikan dan digabungkan. Mereka memiliki "ujung lengket" yang cocok, atau DNA beruntai tunggal yang menggantung, sehingga mereka bisa saling menempel.

Enzim DNA ligase bergabung dengan fragmen dengan ujung yang cocok untuk membentuk molekul DNA tunggal yang tidak terputus. Ini menghasilkan plasmid rekombinan yang mengandung gen target.

2. Transformasi dan seleksi bakteri

Plasmid dan DNA lain dapat dimasukkan ke dalam bakteri, seperti E. coli yang tidak berbahaya yang digunakan di laboratorium, dalam proses yang disebut transformasi . Selama transformasi , sel bakteri yang disiapkan secara khusus diberi kejutan (seperti suhu tinggi) yang mendorong mereka untuk mengambil DNA asing.

DNA yang dihasilkan oleh ligasi (yang mungkin merupakan campuran dari plasmid yang diinginkan, produk samping plasmid, dan potongan DNA linier) ditambahkan ke bakteri. Bakteri diberi kejutan panas, yang membuatnya lebih mudah mengambil DNA melalui transformasi. Namun, hanya sebagian kecil dari bakteri yang berhasil mengambil plasmi

Plasmid biasanya mengandung gen resistensi antibiotik , yang memungkinkan bakteri bertahan hidup dengan adanya antibiotik tertentu. Dengan demikian, bakteri yang mengambil plasmid dapat dipiih pada pelat nutrisi yang mengandung antibiotik. Bakteri tanpa plasmid akan mati, sedangkan bakteri pembawa plasmid dapat hidup dan berkembang biak. Setiap bakteri yang masih hidup akan menghasilkan kelompok kecil, seperti titik, atau koloni , bakteri identik yang semuanya membawa plasmid yang sama.

Panel kiri: Diagram plasmid, menunjukkan bahwa plasmid mengandung gen resistensi antibiotik.

Panel kanan: semua bakteri hasil transformasi ditempatkan di piring antibiotik. Bakteri tanpa plasmid akan mati karena antibiotik. Setiap bakteri dengan plasmid membuat koloni, atau sekelompok bakteri klonal yang semuanya mengandung plasmid yang sama. Koloni yang khas terlihat seperti titik kecil keputihan seukuran kepala peniti.

Tidak semua koloni mengandung plasmid yang tepat. Itu karena, selama ligasi, fragmen DNA tidak selalu "ditempel" persis seperti yang kita inginkan. Sebaliknya, kita harus mengumpulkan DNA dari beberapa koloni dan melihat apakah masing-masing mengandung plasmid yang tepat. Metode seperti pemecahan enzim restriksi dan PCR biasanya digunakan untuk memeriksa plasmid.

3. Produksi protein

Setelah kami menemukan koloni bakteri dengan plasmid yang tepat, kami dapat menumbuhkan kultur besar bakteri pembawa plasmid. Kemudian, kami memberi bakteri sinyal kimia yang memerintahkan mereka untuk membuat protein target.

Bakteri berfungsi sebagai "pabrik" mini, yang menghasilkan protein dalam jumlah besar. Misalnya, jika plasmid kita mengandung gen insulin manusia, bakteri akan mulai mentranskripsikan gen tersebut dan menerjemahkan mRNA untuk menghasilkan banyak molekul protein insulin manusia. 

Koloni yang dipilih dibesarkan dalam kultur besar (mis., Labu 1 liter). Bakteri dalam kultur besar diinduksi untuk mengekspresikan gen yang terkandung dalam plasmid, menyebabkan gen tersebut ditranskripsi menjadi mRNA, dan mRNA tersebut diterjemahkan menjadi protein. Protein yang dikodekan oleh gen terakumulasi di dalam bakteri.

Setelah protein diproduksi, sel bakteri dapat dibelah untuk melepaskannya. Ada banyak protein dan makromolekul lain yang beredar di dalam bakteri selain protein target (misalnya, insulin). Karena itu, protein target harus dimurnikan, atau dipisahkan dari isi sel lainnya dengan teknik biokimia. Protein yang dimurnikan dapat digunakan untuk eksperimen atau, dalam kasus insulin, diberikan kepada pasien.

Kegunaan kloning DNA

Molekul DNA yang dibangun melalui teknik kloning digunakan untuk banyak tujuan dalam biologi molekuler. Daftar contoh singkatnya meliputi:

• Biofarmasi. Kloning DNA dapat digunakan untuk membuat protein manusia dengan aplikasi biomedis, seperti insulin yang disebutkan di atas. Contoh lain dari protein rekombinan termasuk hormon pertumbuhan manusia, yang diberikan kepada pasien yang tidak dapat mensintesis hormon, dan aktivator plasminogen jaringan (tPA), yang digunakan untuk mengobati stroke dan mencegah penggumpalan darah. Protein rekombinan seperti ini sering dibuat dari bakteri.
• Terapi gen. Pada beberapa kelainan genetik, pasien kekurangan bentuk fungsional dari gen tertentu. Terapi gen mencoba memberikan salinan gen normal ke sel-sel tubuh pasien. Misalnya, kloning DNA digunakan untuk membangun plasmid yang mengandung versi normal dari gen yang tidak berfungsi dalam fibrosis kistik. Ketika plasmid dikirim ke paru-paru pasien fibrosis kistik, fungsi paru-paru memburuk lebih cepat$$^ 2kuadrat.
• Analisis gen. Di laboratorium penelitian dasar, ahli biologi sering menggunakan kloning DNA untuk membangun versi gen rekombinan buatan yang membantu mereka memahami bagaimana gen normal dalam suatu organisme berfungsi.

Ini hanyalah beberapa contoh bagaimana kloning DNA digunakan dalam biologi saat ini. Kloning DNA adalah teknik yang sangat umum yang digunakan dalam berbagai macam aplikasi biologi molekuler.

P C R (REAKSI BERANTAI POLIMERISASI))

Reaksi berantai polimerase (PCR)

Teknik yang digunakan untuk memperkuat, atau membuat banyak salinan, wilayah target DNA tertentu. 

Rangkuman:

• Polymerase chain reaction, atau PCR, adalah teknik yang digunakan membuat banyak salinan  DNA dengan urutan tertentu secara in vitro (dalam lab atau tabung reaksi).
• PCR membutuhkan keberadaan DNA polimerase termostabil, Taq polimerase, dan memerlukan DNA primer yang dirancang khusus urutan DNA yang diinginkan.
• Dalam PCR, reaksi berulang kali didaur ulang melalui serangkaian perubahan suhu, yang memungkinkan terbentuknya banyak salinan daerah target diproduksi.
• PCR memiliki banyak penelitian dan aplikasi praktis. Ini secara rutin digunakan dalam kloning DNA, diagnostik medis, dan analisis DNA forensik.

Apa itu PCR?

Polymerase chain reaction ( PCR ) adalah teknik laboratorium umum yang digunakan untuk membuat banyak salinan (jutaan bahkan milyaran salinan DNA) dengan urutan DNA tertentu. Urutan DNA ini biasanya apapun yang diminati pelaku eksperimen. Misalnya, peneliti ingin memahami fungsi gen tertentu, atau memahami penanda genetik yang digunakan oleh ilmuwan forensik untuk mencocokkan DNA yang ditemukan di TKP dengan DNA tersangka.

Tujuan PCR adalah membuat  banyak urutan DNA target sehingga dapat dianalisis atau digunakan dengan cara lain. Misalnya, DNA yang diamplifikasi oleh PCR dapat dikirim untuk diurutkan , divisualisasikan dengan elektroforesis gel , atau diklon ke dalam plasmid bakteri untuk penlitian lebih lanjut.

PCR digunakan di banyak bidang biologi dan kedokteran, termasuk penelitian biologi molekuler, diagnostik medis, dan bahkan beberapa cabang ekologi.

Taq polimerase

Sama halnya dengan proses replikasi DNA dalam tubuh organisme, PCR membutuhkan enzim DNA polimerase yang membuat untaian DNA baru, menggunakan untai yang ada sebagai templat. DNA polimerase yang digunakan dalam PCR disebut Taq polimerase, setelah bakteri tahan panas yang diisolasi ( T hermus aq uaticus ).

T. aquaticus hidup di mata air panas dan ventilasi hidrotermal. DNA polimerase-nya sangat tahan panas dan paling aktif di sekitarnya$$70 ° \ teks C70, °, teks awal, C, teks akhir(suhu di mana DNA polimerase manusia atau E. coli tidak akan berfungsi). Stabilitas panas ini membuat Tag polimerase menjdi ideal digunakan dalam PCR. Seperti yang akan kita lihat, suhu tinggi digunakan berulang kali dalam PCR untuk mengubah sifat DNA template, atau memisahkan untaiannya.

Primer PCR

Seperti DNA polimerase lainnya, DNA tag polimerase hanya dapat membuat DNA jika ada DNA primer. DNA primer adalah urutan pendek nukleotida yang memberikan titik awal untuk sintesis DNA. Dalam reaksi PCR, DNA primer bertindak sebagai pelaku eksperimen yang menentukan wilayah DNA yang akan disalin, atau diperbanyak, oleh DNA primer .

DNA Primer PCR adalah potongan pendek DNA untai tunggal, biasanya di sekelilingnya $$2020nukleotida panjangnya. Dua DNA primer digunakan dalam setiap reaksi PCR, dan dirancang sedemikian rupa sehingga mengapit wilayah target (wilayah yang harus disalin). Artinya, mereka diberi urutan yang akan membuat mereka mengikat untaian berlawanan dari DNA cetakan, tepat di tepi wilayah yang akan disalin. DNA Primer mengikat ke templat dengan pasangan basa komplementer.

DNA template:

5 'TATCAGATCCATGGAGT ... GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3 'ATAGTCTAGGTACCTCA ... CTCATGATCAGGATACTCA 5'

Primer 1: 5 'CAGATCCATGG 3' Primer 2:

Ketika primer terikat ke templat, mereka dapat diperpanjang oleh DNA polimerase, dan daerah yang terletak di antara mereka akan disalin.

[More detailed diagram showing DNA and primer directionality]

Langkah-langkah PCR

Bahan utama dari reaksi PCR adalah 1) Taq polimerase, 2) DNA primer, 3). DNA cetakan, dan 4) nukleotida. Bahan-bahan tersebut dirakit dalam sebuah tabung, bersama dengan kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melalui siklus pemanasan dan pendinginan berulang kali  memungkinkan untai DNA disintesis.

Langkah-langkah dasarnya adalah:

1. Denaturasi ($$96 ° \ teks C96, °, teks awal, C, teks akhir): Pemanasan digunakan untuk memisahkan, atau mengubah sifat, untai DNA. Proses ini menyediakan template untai tunggal untuk langkah berikutnya.
2. Anil ($$5555 - $$6565$$° \ teks C°, teks awal, C, teks akhir): Dinginkan reaksi sehingga DNA primer dapat mengikat urutan komplementernya pada DNA cetakan untai tunggal.
3. Ekstensi ($$72 ° \ teks C72, °, teks awal, C, teks akhir): Naikkan suhu reaksi sehingga Taq polymerase memperluas DNA primer, mensintesis untaian DNA baru.

Siklus ini berulang $$2525 - $$3535 kali dalam reaksi PCR yang khas, yang biasanya memakan waktu $$22 - $$44jam, tergantung pada panjang untai DNA yang sedang disalin. Jika reaksinya efisien (bekerja dengan baik), untai benang target dapat berubah dari satu atau beberapa salinan bahkan menjadi miliaran salinan.

Pada proses ini bukan hanya DNA asli yang digunakan sebagai templat utama. Tapi DNA baru yang terbentuk dalam satu putaran dapat berfungsi sebagai templat di putaran sintesis DNA berikutnya. Ada banyak salinan primer dan banyak molekul tag polimerase yang mengambang di sekitar reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda di setiap putaran siklus. Pola pertumbuhan eksponensial ini ditunjukkan pada gambar di bawah ini.

Menggunakan elektroforesis gel untuk memvisualisasikan hasil PCR

Hasil reaksi PCR biasanya divisualisasikan menggunakan Elektroforesis gel. Elektroforesis gel ini adalah teknik di mana fragmen DNA ditarik melalui matriks gel oleh arus listrik, dan memisahkan fragmen DNA menurut ukurannya. Standar, atau tangga DNA, biasanya disertakan sehingga ukuran fragmen dalam sampel PCR dapat ditentukan.

Fragmen DNA dengan panjang yang sama membentuk "pita" pada gel, yang dapat dilihat dengan mata jika gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA. Misalnya, reaksi PCR menghasilkan a$$400400 pecahan base pair (bp) akan terlihat seperti ini pada gel:

Jalur kiri: Tangga DNA dengan pita 100, 200, 300, 400, 500 bp.

Jalur kanan: hasil reaksi PCR, pita pada 400 bp.

Pita DNA berisi banyak sekali salinan dari daerah DNA target, tidak hanya satu atau beberapa salinan. Karena DNA mikroskopis, banyak salinannya harus ada sebelum kita dapat melihatnya dengan mata. Ini adalah bagian besar mengapa PCR adalah alat penting: PCR menghasilkan salinan yang cukup dari urutan DNA sehingga kita dapat melihat atau memanipulasi untai DNA tersebut.

Aplikasi PCR

Menggunakan PCR, untai DNA dapat ditambahkan jutaan atau milyaran kali, menghasilkan salinan DNA yang cukup untuk dianalisis menggunakan teknik lain. Misalnya, DNA dapat divisualisasikan dengan elektroforesis gel, dikirim untuk mengurutkan, atau dipecah dengan enzim restriksi dan dikloning menjadi plasmid.

PCR banyak digunakan di laboratorium penelitian, dan juga memiliki aplikasi praktis dalam forensik, pengujian genetik, dan diagnostik. Misalnya, PCR digunakan untuk memperkuat gen yang terkait dengan kelainan genetik dari DNA pasien (atau dari DNA janin, dalam kasus pengujian prenatal). PCR juga dapat digunakan untuk menguji bakteri atau virus DNA dalam tubuh pasien: jika ada patogen, dimungkinkan untuk memperkuat daerah DNA-nya dari sampel darah atau jaringan.

Contoh masalah: PCR dalam forensik

Misalkan Anda bekerja di lab forensik. Anda baru saja menerima sampel DNA dari rambut yang tertinggal di TKP, bersama dengan sampel DNA dari tiga tersangka. Tugas mu adalah memeriksa penanda genetik tertentu dan melihat apakah salah satu dari ketiga tersangka cocok dengan DNA rambut untuk penanda ini.

Penanda datang dalam dua alel, atau versi. Satu berisi satu pengulangan (bagian berwarna cokelat di bawah), sedangkan yang lainnya berisi dua salinan pengulangan. Dalam reaksi PCR dengan primer yang mengapit daerah berulang, alel pertama menghasilkan a$$200200 $$\ text {bp}teks awal, b, p, teks akhir Fragmen DNA, sedangkan yang kedua menghasilkan a $$300300 $$\ text {bp}teks awal, b, p, teks akhir Fragmen DNA:

Alel penanda 1: primer mengapit daerah berulang memperkuat fragmen DNA 200 bp

Alel penanda 2: primer mengapit daerah berulang memperkuat fragmen 300 bp DNA

Kamu melakukan PCR pada empat sampel DNA dan memvisualisasikan hasilnya dengan elektroforesis gel, seperti yang ditunjukkan di bawah ini: